Введение в цифровую ПЦР

Цифровая ПЦР (DPCR)-это технология ПЦР третьего поколения, разработанная после обычной ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени (QPCR). Его основной принцип заключается в разделении реакционной смеси, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты-мишени, на десятки тысяч независимых микрореактивных единиц (таких как микро-капель или микроэллеры), с индивидуальной ПЦР-амплификацией, возникающей в каждой единице.

После завершения усиления обнаружение конечной точки (обычно из флуоресцентного сигнала) выполняется на каждой единице. Наличие или отсутствие сигнала определяют, содержит ли эта единица молекулу нуклеиновой кислоты -мишени. Подсчитывая количество положительных единиц и применяя статистику распределения Пуассона, может быть непосредственно рассчитано абсолютное количество копий целевой нуклеиновой кислоты в исходном образце.

Основное преимущество цифровой ПЦР заключается в его способности к абсолютному количественному определению, не полагаясь на стандартную кривую, что приводит к более точным и надежным результатам. Кроме того, он обладает более высокой толерантностью к ингибиторам и демонстрирует превосходную чувствительность в обнаружении мишеней чрезвычайно низкой численности, таких как редкие мутации, следы патогенов и циркулирующую опухолевую ДНК (ctDNA).

Эти особенности позволили DPCR показать огромную ценность применения и потенциал в исследованиях в области науки о жизни и клинической диагностике, включая такие области, как биопсия опухолевой жидкости, неинвазивный пренатальный диагноз, точное обнаружение патогенов, анализ экспрессии генов, количественная оценка трансгенных компонентов и оценка эталонных стандартов.

Типы цифровой ПЦР

Цифровая ПЦР может быть широко классифицирована на три основных типа на основе метода разделения, используемого для разделения выборки на многие отдельные реакционные единицы:

Цифровая ПЦР на основе капель

Этот метод разделяет смесь ПЦР на десятки тысяч крошечных капель с водой в масло, каждый из которых действует как независимый микрореактор ПЦР. Капли генерируются с использованием микрофлюидики, а затем подвергаются усилению ПЦР. После усиления капли анализируются индивидуально на флуоресценцию, чтобы определить положительные или отрицательные разделы. Этот подход предлагает очень большое количество разделов и широко используется для его чувствительности и точности.

Цифровая ПЦР на основе чипов

При таком подходе смесь ПЦР разделяется на десятки тысяч микрокамеров или скважин на микрофлюидном чипе или пластине. Каждая скважина содержит небольшой объем, действующий как изолированная реакция ПЦР. После усиления флуоресцентная визуализация или сканирование считывает сигнал каждого раздела. Системы DPCR на основе чипов часто интегрируют разделение, амплификацию и обнаружение образцов в одном устройстве.

Гибридные методы

К ним относятся технологии реакционного блока на основе капель и метода сканирования на основе чипов, которые объединяют функции систем капель и чипов. Дождь использовал этот метод. Во -первых, десятки тысяч капель генерируются с использованием микрофлюидиков, затем капли распространяются в один слой на чипе. После того, как реакция ПЦР завершена, флуоресцентные сигналы собираются с помощью визуализации так же, как и метод на основе чипов.

Каждая стратегия разделения изолирует молекулы нуклеиновой кислоты в отдельные реакционные компартменты, что позволяет использовать статистику Пуассона для точной количественной оценки молекул ДНК -мишени или РНК путем подсчета положительных и отрицательных разделов. Выбор метода разделения влияет на количество разделов, объема разделов, сложность рабочего процесса и требования приборов.

Статистика Пуассона в цифровой ПЦР

Распределение Пуассона имеет основополагающее значение для цифровой ПЦР, поскольку оно моделирует вероятность того, что любой заданный раздел содержит молекулы ноль, один или несколько целевых. Рассматривая эти вероятности, статистика Пуассона обеспечивает точную оценку среднего количества целевых молекул на раздела. В частности, когда известен средний объем каждого разделения (VP), модель Пуассона может быть применена для расчета абсолютной концентрации молекул нуклеиновой кислоты -мишени на единицу объема.

Ключевое понимание распределения Пуассона заключается в том, что доля негативных разделов (без каких -либо целевых молекул) отражает вероятность нулевых молекул в разделе, что позволяет расчет средней занятости (λ) во всех разделениях. Этот подход исправляет возможность того, что некоторые положительные разделы содержат более одной молекулы, предотвращая недооценку концентрации цели.

Точное измерение каждой переменной - позитивные разделы, общие разделы и объем разделов - важно, так как любая ошибка может напрямую повлиять на точность концентрации концентрации нуклеиновой кислоты. В целом, распределение Пуассона обеспечивает статистическую структуру, которая преобразует бинарные данные положительного/отрицательного раздела в абсолютную и высоко точную количественную оценку целевых молекул в цифровой ПЦР.

Как рассчитать копии/капель и копии/мкл в цифровой ПЦР?

Общее количество копий целевой молекулы во всех действительных капель образца рассчитывается путем умножения копий целевой молекулы на капли с количеством действительных капель. Основываясь на известном количестве копий целевой молекулы на капли (λ) и объема капель, также можно рассчитать копии на микролитр.

Formulas for calculate copies/droplet and copies/µL in digital PCR

Концентрация ДНК -мишени в исходной 2 мл крови составляет приблизительно 35 846 экземпляров/мл.

Каков рабочий процесс цифровой ПЦР -серии Dropdx?

Цифровой рабочий процесс ПЦР прост. Обычно он охватывает следующие этапы:

1. Подготовка реакционной смеси

Рабочий процесс обнаружения цифровой ПЦР (DPCR) начинается с экстракции нуклеиновой кислоты из образца для изоляции ДНК или РНК. После экстракции очищенные нуклеиновые кислоты смешивают с мастермиксом ПЦР, включая праймеры, флуоресцентные зонды, нуклеотиды, ферменты и специализированный супермикс, предназначенный для образования капель.

2. Образец загрузки

3. Generation и ПЦР

4. Чип для чтения и анализ данных

Каков рабочий процесс цифровой серии PCR RS32?

Цифровая система Digital PCR RS32 All-in-One предлагает полностью автоматизированный »образец, результат ». После простой подготовки образца и загрузки образца на чип пользователям необходимо только установить необходимые параметры. Как только чип помещен в машину RS32, весь процесс обнаружения проходит автоматически без какого -либо дальнейшего ручного вмешательства. Этот оптимизированный процесс устраняет необходимость в практических шагах во время анализа, достигая полной автоматизации от ввода выборки до результата вывода.

Преимущества и ограничения цифровой ПЦР

Преимущества:

Преимущество	Описание
Абсолютное количественное определение	Непосредственно считает целевые молекулы без необходимости стандартной кривой или ссылки, повышая надежность.
Высокая точность и воспроизводимость	Предоставляет более точные и воспроизводимые результаты, особенно для целей с низким содержанием и небольшими изменениями сгиба.
Превосходная чувствительность	Обнаружает чрезвычайно низкие концентрации мишеней, таких как редкие мутации, следы патогенов и ctDNA.
Высокая терпимость к ингибиторам	Разделение уменьшает влияние ингибиторов ПЦР, позволяя устойчивому количественному определению даже в сложных образцах.
Нет полагаться на эффективность усиления	Результаты меньше влияют на вариации эффективности ПЦР, что приводит к более точной количественной оценке.

Недостатки:

Недостаток	Описание
Более узкий динамический диапазон	Ограниченное количество разделов ограничивает диапазон целевых концентраций, которые могут быть точно определены, часто требуя разбавления образца для высокопрофильных мишеней.
Более высокая стоимость	Оборудование и расходные материалы для DPCR, как правило, дороже, чем для QPCR.
Ниже пропускная способность	DPCR обычно обрабатывает меньше образцов на пробег.
Ограниченное разнообразие комплекта реагентов	Коммерциализированные наборы реагентов по -прежнему ограничены в разнообразии, и еще меньше наборов получили квалификацию для использования в больницах.
Неинтерзамируемые наборы реагентов	Поскольку методы разделения различаются, наборы реагентов от разных производителей цифровых ПЦР не являются взаимозаменяемыми.

Сравнение между цифровой ПЦР и QPCR

КПЦР идеально подходит для высокопроизводительных экспериментов с широким динамическим диапазоном и быстрыми результатами. Это количественно, но обычно требует стандартных кривых или ссылок, и на его точность может зависеть от ингибиторов и эффективности ПЦР.

DPCR предлагает абсолютную количественную оценку без стандартов, превосходен в чувствительности и точке для низкого количества или редких мишеней и более устойчив к ингибиторам. Выбор между QPCR и DPCR зависит от целей эксперимента, типа выборки и требуемой чувствительности.

Сравнительная таблица: QPCR против DPCR

Функция/аспект	ПЦР в реальном времени (КПЦР)	Цифровая ПЦР (DPCR)
Количественная оценка	Относительно или абсолютный (требуют стандартных кривых или ссылок)	Абсолют (не требуются стандарты или ссылки)
Формат реакции	Объемная ПЦР, гибкие объемы реакции	Образец разделения, фиксированные объемы раздела
Влияние эффективности ПЦР	Полияет изменения в эффективности ПЦР (данные, собранные на экспоненциальной фазе)	Не влияют на изменение эффективности усиления
Толерантность к ингибиторам	Подвержен ингибиторам	Более высокая толерантность к ингибиторам
Метод обнаружения	Обнаружение в реальном времени	Обнаружение конечной точки
Динамический диапазон	Широкий динамический диапазон	Более узкий динамический диапазон
Чувствительность	Более высокие изменения, менее чувствительные к редким мишеням	Обнаруживает небольшие изменения и редкие цели, более высокая чувствительность
Воспроизводимость	Умеренные, могут влиять различные факторы	Более высокая воспроизводимость
Статистическая сила	Ниже	Выше
Зрелость протокола	Хорошо установленные протоколы	Легкий переход от QPCR, но протоколы все еще развиваются
Пропускная способность	Высокий	Ниже

Сравнение цифровой ПЦР (DPCR) и секвенирования следующего поколения (NGS)

Цифровая ПЦР (DPCR) и секвенирование следующего поколения (NGS) являются дополнительными технологиями в молекулярной биологии и клинической диагностике. Вместо того, чтобы конкурировать, они часто используются вместе, чтобы максимизировать аналитическую силу:

NGS идеально подходит для широкого открытия, идентифицируя широкий спектр генетических вариантов и биомаркеров без предварительного знания мутаций. Он имеет основополагающее значение для комплексной DPCR обеспечивает сверхчувствительную проверку и точную количественную оценку конкретных целей, что делает его подходящим для отслеживания известных мутаций или редких вариантов с течением времени, особенно при мониторинге ответа на лечение.

Ngs	Цифровая ПЦР	Цифровая ПЦР
Предел обнаружения	10% -5% для WGS и WES	0,1%-0,001%
Анализ данных	Обширная поддержка биоинформатики, требующая интерпретация данных	Простой
Требование к знаниям мутации	Предварительное знание мутаций не требуется	Необходимый
Область обнаружения	Сотни на целый экзом или весь геном	Ограничен
Количественная оценка	Полуколичественный	Абсолютное количественное определение
Типы обнаруженных изменений	Изменения числа копий, структурные перестройки, SNV или метилирование изменений в целом геноме/панелях	Возможно на отдельных генах/регионах
Время переключения (TAT)	Длинный	Короткий
Расходы	Высокий	Низкий

Эти технологии часто интегрированы в рабочие процессы: NGS для обнаружения и профилирования, за которым следует DPCR для чувствительного, количественного мониторинга выбранных целей. Эта синергия особенно ценна в области точной медицины, онкологии, мониторинга инфекционных заболеваний и генетического тестирования.

Приложения цифровой ПЦР

Цитаты

1. Mu H, Zou J, Zhang H. (2024). Количественное обнаружение мутаций T315I BCR :: ABL1 с использованием цифровой полимеразной цепной реакции. Гематол -трансфус -клетки Ther. 17: S2531-1379 (24) 00030-0. doi: 10.1016/j.htct.2023.12.007.

2. Zhao Z, Wang Y, Kang Y, et al. (2024). Ретроспективное исследование обнаружения патогенов сепсиса, сравнивающих культуру крови и независимую от культуры цифровой ПЦР. Гелион. 10 (6): E27523. doi: 10.1016/j.heliyon.2024.e27523.

3. Mao S, Lin Y, Qin X, et al. (2024). Цифровая ПЦР капель: эффективный метод мониторинга и прогностической оценки минимального остаточного заболевания в JMML. Br J Gaematol. 204 (6): 2332-2341. doi: 10.1111/bjh.19465.

4. Chen J, Liu X, Zhang Z, et al. (2024). Ранние диагностические маркеры для плоскоклеточного карциномы пищевода: идентификация гена изменения копий и обнаружение CFDNA. Лабораторная инвестиция. 104 (10): 102127. doi: 10.1016/j.labinv.2024.102127.

5. He Y, Dong L, Yan W, et al. (2024). Мультиплексная система ПЦР для обнаружения и количественной оценки четырех генетически модифицированных событий сои. Перепластись квадрат. doi: 10.21203/rs.3.rs-4766822/v1.

6. Dong L, Li W, Xu Q, et al. (2023). Быстрый мультиплексный анализ паразитов малярии человека с помощью цифровой ПЦР. Clin Chim Acta. 539: 70-78. doi: 10.1016/j.cca.2022.12.001.

7. Kopylova KV, Kasparov EW, Marchenko IV, et al. (2023). Цифровая ПЦР как высокочувствительный диагностический инструмент: обзор. Моль био (Mosk). 57 (5): 771-781. doi: 10.31857/s0026898423050051. [Статья на русском языке]

8. Lu R, Wang J, Li M, et al. (2022). Ретроспективное количественное обнаружение SARS-COV-2 с помощью цифровой ПЦР, показывающая высокую точность для образцов с низкой вирусной нагрузкой. J Infect Dev Ctries. 16 (1), 10-15. doi: 10.3855/jidc.15315.

Связанный комплект

Кошка №	Имя
3.02.03.0001	BCR ABL P210/P190 Цифровой ПЦР Тест на одну трубку
3.02.03.0005	PIK3CA 11 Мутации цифровой ПЦР -анализ
3.02.03.0006	Набор для обнаружения мутаций человеческого гена jak2 (цифровой метод ПЦР)
3.02.03.0008	Набор для обнаружения генов малярии 18S RRNA (цифровая ПЦР)
3.02.03.0009	Fastplex ™ BCR-ABL (P210) %-цифровой комплект для ПЦР
3.02.01.4066	Цифровой мастермикс ПЦР для зондов
3.02.01.4071	Анализ обнаружения мутаций гена ALK человека G1269A
3.02.01.4072	Анализ обнаружения мутаций гена BRAF человека V600E
3.02.01.4073	Анализ обнаружения мутаций гена EGFR человека G465R
3.02.01.4074	Анализ обнаружения мутаций гена EGFR человека G719
3.02.01.4075	Анализ обнаружения мутаций гена EGFR человека G719A
3.02.01.4076	Анализ обнаружения мутаций Гена EGFR EGFR E746_A750DELELERA (COSM6223)
3.02.01.4077	Анализ обнаружения мутаций Гена EGFR EGFR E746_A750DELELREA (COSM6225)
3.02.01.4078	Человеческий ген EGFR L747_A750DELINSP (COSM2238) Анализ обнаружения мутаций
3.02.01.4079	Человеческий ген EGFR L747_A750DELINSP (COSM2239) Анализ обнаружения мутаций
3.02.01.4080	Анализ обнаружения мутаций EGFR Human EGFR L747_P753> S
3.02.01.4081	Анализ обнаружения мутаций гена EGFR человека S768I
3.02.01.4082	Анализ обнаружения мутаций EGFR человека V769_D770INSASV
3.02.01.4083	Анализ обнаружения мутаций Гена EGFR человека D770_N771INSG
3.02.01.4084	Анализ обнаружения мутаций гена EGFR человека T790M
3.02.01.4085	Анализ обнаружения мутаций Гена EGFR C797S (COSM6493937)
3.02.01.4086	Анализ обнаружения мутаций (COSM5945664) Человеческий ген EGFR C797S (COSM5945664)
3.02.01.4087	Анализ обнаружения мутаций гена EGFR человека L858R
3.02.01.4088	Анализ обнаружения мутаций человека EGFR EGF
3.02.01.4089	Анализ обнаружения мутаций гена ESR1 человека Y537S
3.02.01.4090	Анализ обнаружения мутаций гена ESR1 человека D538G
3.02.01.4091	Анализ обнаружения мутации гена человека G12D
3.02.01.4092	Анализ обнаружения мутаций генов человеческого гена G12V

Кошка №	Имя
3.02.01.4093	Анализ обнаружения мутации гена человека G12C
3.02.01.4094	Анализ обнаружения мутации гена человека G12A
3.02.01.4095	Анализ обнаружения мутаций генов человека G12S
3.02.01.4096	Анализ обнаружения мутаций генов человека G13D
3.02.01.4097	Анализ обнаружения мутаций гена NRAS человека G12V
3.02.01.4098	Анализ обнаружения мутаций гена NRAS человека Q61R
3.02.01.4099	Анализ обнаружения мутации гена PIK3CA человека PIK3CA
3.02.01.4100	Анализ обнаружения мутаций гена PIK3CA человека PIK3CA
3.02.01.4101	Анализ обнаружения мутаций гена PIK3CA человека H1047R
3.02.01.4102	Анализ обнаружения мутаций гена TP53 человека R175H
3.02.01.4103	Анализ обнаружения мутаций гена TP53 человека R248L
3.02.01.4104	Анализ обнаружения мутаций гена TP53 человека R273C
3.02.01.4105	Анализ обнаружения мутаций гена TP53 человека R273H
3.02.01.4106	Анализ обнаружения вариации гена HER2 HER2
3.02.01.4108	Анализ обнаружения вируса вируса человека H1N1 -2009
3.02.01.4109	Анализ обнаружения вируса вируса человека гриппа A
3.02.01.4113	Анализ обнаружения вируса вируса человека (BAMHI-W)
3.02.01.4114	Анализ обнаружения вируса вируса человека (EBNA1)
3.02.01.4115	Анализ обнаружения CMV человека
3.02.01.4117	Анализ обнаружения мутаций BCR-ABL T315I
3.02.01.4120	Анализ обнаружения мутаций гена IDH1 человека R132C
3.02.01.4121	Анализ обнаружения мутаций гена IDH1 человека R132G
3.02.01.4122	Анализ обнаружения мутаций гена человека R132H
3.02.01.4123	Анализ обнаружения мутаций MyD88 Human MyD88
3.02.01.4130	Человеческий набор для обнаружения генов BCR-ABL (P210) (цифровая ПЦР)
3.02.01.4138	Анализ обнаружения BCR-ABL P190
3.02.01.4265	Набор для обнаружения SARS-COV-2 (RT-DPCR)
3.02.01.4277	Комплект для обнаружения патогенных микроорганизма сепсис (цифровой ПЦР)