Просмотры:0 Автор:Pедактор сайта Время публикации: 2025-03-24 Происхождение:Работает
ПЦР в реальном времени, также известная как количественная ПЦР (КПЦР), является мощной и важной техникой в современной молекулярной биологии. Это позволяет усилить и количественно определять специфические последовательности ДНК или РНК во время ПЦР -процесса, что позволяет точно измерить экспрессию генов, обнаружение патогенов и генетический анализ. В отличие от традиционной ПЦР, которая дает качественные результаты только после завершения реакции, ПЦР в реальном времени предлагает непрерывный мониторинг процесса усиления, получая количественные данные. В этой статье мы рассмотрим, что такое ПЦР в реальном времени, как она работает, и ее приложения в различных областях.
Система ПЦР в реальном времени является расширенной версией стандартной машины для ПЦР. Он объединяет систему обнаружения флуоресценции для мониторинга накопления продуктов ПЦР в процессе усиления. Эта система предоставляет данные в реальном времени о количестве ДНК или РНК, амплифицированной, которые могут использоваться как для качественного, так и для количественного анализа. Системы ПЦР в реальном времени широко используются в клинической диагностике, генетических исследованиях и различных других молекулярных приложениях.
● Количественная оценка ДНК и РНК: ПЦР в реальном времени обеспечивает точное количественное определение нуклеиновых кислот путем измерения флуоресценции, излучаемой во время циклов амплификации. Это позволяет обнаружить даже небольшое количество ДНК или РНК с высокой чувствительностью.
● Непрерывный мониторинг: в отличие от обычной ПЦР, где результаты определяются после завершения реакции, системы ПЦР в реальном времени контролируют реакцию по мере ее возникновения. Это позволяет исследователям наблюдать за процессом амплификации в режиме реального времени и получать точные количественные данные.
● Обнаружение флуоресценции. Наиболее часто используемыми методами обнаружения флуоресценции в ПЦР в реальном времени являются ДНК-связывающие красители (такие как Sybr Green) и специфичные для последовательности зонды (такие как зонды Taqman). Эти флуоресцентные молекулы испускают свет, когда связаны с амплифицированной ДНК, и интенсивность флуоресценции коррелирует с количеством ДНК в образце.
Принцип ПЦР в реальном времени аналогичен принципу традиционной ПЦР, но с дополнительным поворотом: процесс усиления контролируется в режиме реального времени путем обнаружения флуоресценции. Ключевые шаги в процессе ПЦР в реальном времени следующие:
1. Денатурация: Двойная ДНК нагревается, чтобы разделить нити, создавая одноцепочечные шаблоны для усиления.
2. Отжиг: температура снижается, чтобы позволить конкретным праймерам связываться с их дополнительными последовательностями на одноцепочечной ДНК.
3. Расширение: температура корректируется, чтобы дать ДНК -полимеразу расширить праймеры, синтезируя новые пряди ДНК.
4. Измерение флуоресценции: во время фазы удлинения флуоресцентный краситель или зонд связываются с амплифицированной ДНК. Флуоресценция, излучаемая красителем или зондом, измеряется после каждого цикла. Количество флуоресценции пропорциональна количеству амплифицированной ДНК, что позволяет контролировать в реальном времени.
В ПЦР в реальном времени данные флуоресценции, собранные в течение каждого цикла, построены для создания кривой усиления. Эта кривая обычно показывает две отдельные фазы:
● Экспоненциальная фаза: во время этой фазы количество ДНК удваивается с каждым циклом, а флуоресценция увеличивается в геометрической прогрессии. Именно здесь происходит количественная оценка, так как флуоресценция прямо пропорциональна количеству ДНК в образце.
● Фаза плато: после определенного количества циклов реакция достигает плато, где реагенты истощаются, а скорость усиления замедляется. Данные с экспоненциальной фазы используются для точной количественной оценки.
Существует два основных типа анализов ПЦР в реальном времени: анализы на основе зеленых и анализы на основе зондов.
а Sybr Green-это ДНК-связывающий краситель, который флуоресцирует, когда он связывается с двухцепочечной ДНК. Это простой и экономичный метод обнаружения амплифицированной ДНК.
беременный Этот метод работает хорошо, когда праймеры очень специфичны и усиливают только одну цель. Однако Sybr Green может связываться с любой двухцепочечной ДНК, что означает, что неспецифические продукты могут привести к неточным результатам.
а Анализы на основе зондов используют флуоресцентно меченные ДНК-зонды, которые связываются с целевой последовательности между двумя праймерами. Эти зонды, как правило, представляют собой зонды Taqman или аналогичные системы, которые высвобождают флуоресценцию при расщеплении во время процесса усиления.
беременный Анализы на основе зондов предлагают большую специфичность, чем анализы Sybr Green, поскольку они полагаются на три компонента (праймеры и зонд), чтобы связываться с мишенью, снижая вероятность неспецифической амплификации.
в Этот метод идеально подходит для мультиплексных анализов, где несколько целей обнаруживаются одновременно в одной реакции.
Системы ПЦР в реальном времени стали незаменимыми инструментами в различных областях биологических исследований и диагностики. Некоторые из наиболее распространенных приложений включают:
ПЦР в реальном времени широко используется для количественного анализа экспрессии генов. Исследователи могут измерить количество специфической мРНК в образце путем преобразования в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскрипции (RT), а затем количественно определяют кДНК с использованием ПЦР в реальном времени. Этот метод полезен для понимания регуляции генов, изучения клеточных реакций на стимулы окружающей среды и анализ влияния лекарств или лечения на экспрессию генов.
ПЦР в реальном времени является мощным инструментом для обнаружения патогенов, таких как вирусы, бактерии и грибы. Это обеспечивает быстрое и чувствительное обнаружение инфекционных агентов, что делает его важным для клинической диагностики. Например, ПЦР в реальном времени широко используется для обнаружения вирусных инфекций, таких как ВИЧ, грипп и Covid-19, а также бактериальные инфекции, такие как туберкулез.
ПЦР в реальном времени обеспечивает точную количественную оценку ДНК или РНК в образце. Это особенно полезно в таких приложениях, как измерение вирусных нагрузок в клинических образцах, определение изменений числа копий генов и мониторинг прогресса реакций ПЦР в режиме реального времени.
ПЦР в реальном времени также используется в мониторинге окружающей среды для обнаружения микроорганизмов в воде, почве и воздухе. Например, его можно использовать для обнаружения водных патогенов или оценки наличия генетически модифицированных организмов (ГМО) в пищевых и сельскохозяйственных продуктах.
Исследователи используют ПЦР в реальном времени для изучения генетических мутаций, полиморфизмов и делеций генов. Способность количественной оценки специфических генетических последовательностей позволяет обнаружить мутации в исследованиях рака, генетических заболеваниях и персонализированной медицине.
ПЦР в реальном времени предлагает несколько преимуществ по сравнению с традиционной ПЦР, что делает его предпочтительным выбором во многих лабораториях:
● Количественная оценка: ПЦР в реальном времени дает количественные результаты, что позволяет точно измерять нуклеиновые кислоты в образце.
● Скорость: ПЦР в режиме реального времени устраняет необходимость в обработке после ПЦР, такой как гель-электрофорез, сокращая время, необходимое для получения результатов.
● Чувствительность: ПЦР в реальном времени может обнаружить даже небольшое количество ДНК или РНК, что делает его идеальным для применений, которые требуют высокой чувствительности.
● Автоматизация. Многие системы ПЦР в реальном времени полностью автоматизированы, увеличивают пропускную способность и снижают потенциал для человеческой ошибки.
● Снижение риска загрязнения: поскольку ПЦР в реальном времени выполняется в закрытых трубах, риск загрязнения сводится к минимуму.
Системы ПЦР в реальном времени произвели революцию в том, как исследователи анализируют ДНК и РНК. Их способность обеспечить, количественные данные в реальном времени с высокой чувствительностью и точностью сделали их незаменимыми в таких областях, как диагностика, анализ экспрессии генов, обнаружение патогенов и генетические исследования. Независимо от того, изучаете ли вы регуляцию генов, обнаруживаете инфекционные заболевания или монизируете здоровье окружающей среды, система ПЦР в реальном времени предлагает непревзойденную точность и эффективность.
Если вы хотите расширить возможности вашей лаборатории с помощью передовых систем ПЦР в реальном времени, мы предлагаем высокопроизводительные машины, предназначенные для удовлетворения потребностей современных исследований. Наши системы ПЦР в реальном времени обеспечивают точные, надежные результаты, позволяя вашей команде с легкостью проводить высококачественные исследования и диагностику. Свяжитесь с нами сегодня, чтобы обсудить, как наши решения могут удовлетворить потребности вашей лаборатории и улучшить ваши результаты исследований.
