Просмотры:0 Автор:Pедактор сайта Время публикации: 2025-03-24 Происхождение:Работает
Реакция обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) является важным и мощным методом, используемым в молекулярной биологии для амплификации и анализа последовательностей РНК. В отличие от традиционной ПЦР, которая в первую очередь используется для амплификации ДНК, RT-PCR позволяет усилить РНК, сначала превращая ее в комплементарную ДНК (кДНК). Этот метод является ключевым для различных применений, таких как анализ экспрессии генов, обнаружение патогенов и генетические исследования. Понимание принципов, лежащих в основе машин ОТ-ПЦР, имеет решающее значение для исследователей, которые хотят выполнить точное и точное количественное определение РНК.
В этой статье мы рассмотрим принцип ОТ-ПЦР, сосредоточившись на том, как работает машина RT-PCR, биохимические процессы и ее применения в научных исследованиях и диагностике.
ОТ-ПЦР-это комбинация двух ключевых процессов: обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. Здесь мы разбиваем каждый шаг и объясняем, как он работает в машине.
Первый шаг в ОТ-ПЦР включает преобразование РНК в комплементарную ДНК (кДНК) посредством процесса, называемого обратной транскрипцией. Это важный шаг, так как сама полимеразная цепная реакция может только амплифицировать ДНК, а не РНК.
● Фермент обратной транскриптазы: фермент, ответственный за этот процесс, называется обратной транскриптазой. Это РНК-зависимая ДНК-полимераза, которая синтезирует ДНК, используя РНК в качестве матрицы. Этот фермент получен из ретровирусов, где возникает обратная транскрипция для преобразования геномов РНК в ДНК.
● Праймеры для обратной транскрипции: чтобы начать синтез кДНК, требуются праймеры. В RT-PCR можно использовать три типа праймеров:
○ Праймеры олиго (DT) связываются с хвостом РНК поли-а из РНК мессенджера (мРНК) и обычно используются для генерации полноразмерной кДНК из мРНК.
○ Случайные праймеры связываются в различных точках вдоль матрицы РНК и могут использоваться для более широкого диапазона типов РНК.
○ Последовательные праймеры используются для нацеливания на конкретную последовательность РНК, обеспечивая более высокую специфичность в процессе конверсии.
● Контроль температуры: обратная транскрипция обычно происходит при температуре от 40 ° C до 50 ° C. Это позволяет эффективно работать в обратной транскриптазной ферменте при синтезе кДНК из РНК -шаблонов.
После того, как РНК была обратной транскрибированной в кДНК, следующим шагом является амплификация посредством обычной ПЦР. КДНК теперь служит шаблоном для процесса усиления.
● Тепловая цикл: машина выполняет термический цикл, который включает в себя чередующиеся циклы денатурации, отжига и расширения для усиления кДНК. Стадия денатурации включает нагревание реакции, чтобы разделить двухцепочечную кДНК на отдельные цепи. Затем праймеры отжигают свои дополнительные последовательности на одноцепочечной кДНК во время фазы отжига. Наконец, ДНК -полимераза удлиняет праймеры, синтезируя новые нити кДНК.
● ДНК -полимераза: фермент, ответственный за амплификацию кДНК, обычно представляет собой полимераза TAQ, который является термостабильным и может противостоять высоким температурам, необходимым на фазе денатурации.
● Обнаружение флуоресценции: в ПЦР в реальном времени (или количественной ПЦР, QPCR) флуоресценция выделяется в процессе усиления, чтобы предоставить данные в реальном времени о количестве полученной кДНК. Флуоресцентные красители, такие как Sybr Green или последовательно-специфические зонды, используются для обнаружения амплифицированной ДНК, при этом интенсивность флуоресценции непосредственно пропорциональна количеству ДНК в образце.
Возможность количественной оценки РНК с использованием ОТ-ПЦР является одной из самых ценных особенностей. Это достигается за счет измерения флуоресценции в каждом цикле процесса ПЦР. Отслеживая флуоресценцию, испускаемую во время экспоненциальной фазы амплификации, исследователи могут оценить начальную величину РНК в образце.
● Значение порога цикла (CT): измерение ключа в ПЦР в реальном времени -это значение порога цикла (CT), которое соответствует количеству циклов, необходимых для превышения предварительно определенного порога. Чем ниже значение КТ, тем выше начальная величина РНК в образце, так как требуется меньше циклов, чтобы достичь обнаруживаемых уровней флуоресценции.
RT-PCR может быть выполнен с использованием одного шага или двухэтапного подхода, в зависимости от экспериментальных потребностей.
В одноэтапной ОТ-ПЦР как обратная транскрипция, так и амплификация ПЦР выполняются в одной и той же реакционной трубе. Этот подход часто предпочтительнее, когда рабочий процесс должен быть упрощен и когда требуется высокая пропускная способность. Процесс объединяет оба фермента - реверс -транскриптазу и ДНК -полимеразу - на одну реакцию. Этот метод быстрее и снижает риск загрязнения между шагами.
● Преимущества:
○ меньше экспериментальных вариаций.
○ меньше этапов пипетирования, снижая риск загрязнения.
○ Подходит для высокопроизводительных приложений.
● Недостатки:
○ Не может оптимизировать обратную транскрипцию и условия ПЦР отдельно.
○ менее чувствителен, чем двухэтапный ОТ-ПЦР, как условия реакции являются компромиссом.
В двухэтапных ОТ-ПЦР процессы обратной транскрипции и амплификации ПЦР выполняются в отдельных реакциях. Во -первых, РНК преобразуется в кДНК, а затем кДНК используется в отдельной реакции ПЦР для усиления желаемых последовательностей целевых.
● Преимущества:
○ Большая гибкость в оптимизации условий реакции как для обратной транскрипции, так и для амплификации ПЦР.
○ Производимая кДНК может храниться для будущего использования в нескольких реакциях ПЦР.
● Недостатки:
○ Более трудоемкий и трудоемкий.
○ Большой риск загрязнения из -за обработки нескольких трубок и образцов.
Машины ОТ-ПЦР предназначены для удовлетворения конкретных требований процесса ОТ-ПЦР. К ним относятся:
● Тепловой циклер: сердечный компонент машины ОТ-ПЦР, термоцикл отвечает за регуляцию температуры во время процесса ПЦР. Термальный циклер обеспечивает необходимые температуры для денатурации, отжига и расширения, а также для обратной транскрипции.
● Система оптического обнаружения: системы ПЦР в реальном времени оснащены системой оптического обнаружения, которая измеряет флуоресценцию в процессе усиления. Эта система включает в себя источник света (обычно светодиоды) и детектор (часто фотоумножительную трубку или камеру CCD) для захвата испускаемого света.
● Программное обеспечение для анализа данных: машина RT-PCR включает в себя сложное программное обеспечение, которое анализирует данные флуоресценции, собранные во время каждого цикла ПЦР. Это программное обеспечение вычисляет значения КТ и генерирует кривые амплификации, которые затем используются для количественного анализа.
ОТ-ПЦР широко используется во многих областях, в том числе:
1. Анализ экспрессии генов: ОТ-ПЦР является неоценимым для изучения экспрессии генов путем количественной оценки уровней мРНК в различных тканях или клетках. Это позволяет исследователям понять, как регулируются гены в ответ на стимулы, такие как заболевания, лекарства или факторы окружающей среды.
2. Обнаружение патогенов: ОТ-ПЦР обычно используется для обнаружения РНК-вирусов, таких как ВИЧ, грипп и SARS-COV-2. Количественной количественной оценкой вирусной РНК в клинических образцах RT-PCR может помочь контролировать уровни инфекции и руководствоваться решениями о лечении.
3. Генетические исследования и диагностика: ОТ-ПЦР играет решающую роль в генетических исследованиях, включая изучение генных мутаций и генетических нарушений. Он также используется в диагностическом тестировании для таких состояний, как рак, генетические заболевания и микробные инфекции.
Принцип машины ОТ-ПЦР основан на комбинации обратной транскрипции и амплификации ПЦР, что позволяет обнаружить и количественно определять молекулы РНК. Мониторинг амплификации в реальном времени посредством обнаружения флуоресценции обеспечивает высокочувствительные, количественные данные, которые неоценимы в исследованиях экспрессии генов, обнаружении патогенов и генетических исследованиях. С точностью и универсальностью RT-PCR остается незаменимым инструментом как в исследованиях, так и в клинической диагностике.
Если вы ищете передовые системы ОТ-ПЦР для поддержки ваших исследований или диагностических приложений, наши современные решения предназначены для достижения точных, надежных и эффективных результатов. Свяжитесь с нами сегодня, чтобы обсудить, как наши машины RT-PCR могут помочь вам в достижении ваших целей исследования с высокой точностью и чувствительностью. Позвольте нам помочь вам в выборе лучших решений RT-PCR для потребностей вашей лаборатории.
